Digitale Evolution: Wie Informatik und KI die Mikroskopie-Innovation vorantreiben und die Biowissenschaften voranbringen

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Biologen und andere Biowissenschaftler verlassen sich auf die Mikroskopie, um Zellen und Gewebe in biologischen Proben detailliert sichtbar zu machen. Um Proben zu charakterisieren, um biologische Prozesse, einschließlich Krankheitsmechanismen, zu verstehen, setzen Forscher zunehmend eine Multiplex- oder Mehrfarben-Mikroskopietechnik ein. Auf diese Weise können Sie verschiedene Elemente der Probe mit unterschiedlichen Farben färben – zum Beispiel könnte der Kern einer Zelle blau sein, während die Zellmembran rot gefärbt wird.

Da jeder Fluorophor ein charakteristisches Emissionsspektrum hat – den Wellenlängenbereich, in dem er Licht emittiert – ist die Wahl der Fluorophore entscheidend, wenn verschiedene Farbstoffe gleichzeitig verwendet werden, um Wechselwirkungen zu untersuchen. Da die meisten Fluorophore ein breites Emissionsspektrum haben, ist es wichtig, bei der Verwendung von zwei oder mehr Fluorophoren diejenigen auszuwählen, bei denen die Überlappung der Emissionsspektren minimal ist. Wenn es zu Überlappungen kommt, stören sich ihre Signale gegenseitig in einem Phänomen, das als „Übersprechen“ bekannt ist, wodurch die resultierenden Daten schwer zu interpretieren sind.

Daher ist es wichtig, dass Fluorophore gut unterschieden werden, um beim Multiplexen optimale Ergebnisse zu erzielen. Beispiele dafür, wann dies erforderlich ist, umfassen die Untersuchung verschiedener Immunzellen in Bezug auf wichtige Biomarker in immunonkologischen Studien und die diskrete Visualisierung mehrerer Proteine, um verschiedene Arten von Neuronen in komplexen synaptischen Netzwerken in neurowissenschaftlichen Studien zu identifizieren (siehe Abbildung 1).1


Abbildung 1: Gehirn erwachsener Ratten, sichtbar gemacht unter Verwendung von Multicolor- oder Multiplex-Mikroskopie. Die neuronalen Zellen wurden mit dem Fluorophor Alexa Fluor488 grün gefärbt; die Astrozyten wurden mit einem glialen fibrillären sauren Protein (GFAP)-Färbemittel rot gefärbt, und die Zellkerne wurden mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) blau gefärbt. Bild mit freundlicher Genehmigung von Prof. En Xu, Institut für Neurowissenschaften und Abteilung für Neurologie des zweiten angegliederten Krankenhauses der Medizinischen Universität Guangzhou, China.1

Algorithmische Lösungen, die neue Möglichkeiten zur Interpretation von Daten bieten

Um die Herausforderungen der Multiplex-Mikroskopie zu bewältigen, wurden automatisierte Tools entwickelt, die Forschern dabei helfen, Spektralbereiche algorithmisch zu „entmischen“ – wodurch schnellere, intelligentere und qualitativ hochwertigere Daten erzeugt und neue Möglichkeiten zur Interpretation von Bilddaten bereitgestellt werden. Zum Beispiel Dr. Francesco Cutrale Sonstiges Scott E. Fraser am Translational Imaging Center der University of Southern California (USC) haben eine neue Möglichkeit entwickelt, zwei bestehende Methoden zu kombinieren und mithilfe einfacher Algorithmen intelligent zu automatisieren, damit Wissenschaftler Bilder, die mit mehreren fluoreszierenden Markern erstellt wurden, sofort in einem erfassen, speichern und analysieren können gehen.2.3

Die erste Methode ist die hyperspektrale Bildgebung, die ursprünglich für die Fernerkundung durch über Land fliegende Flugzeuge oder um die Erde fliegende Satelliten entwickelt wurde. Diese Art der Bildgebung beinhaltet die zusätzliche Dimension der Wellenlänge, indem sie verschiedene Lichtwellenlängen gleichzeitig in einer großen Anzahl von Kanälen erfasst, anstatt nacheinander jeweils einfarbige Bilder in einer kleineren Anzahl von Kanälen aufzunehmen.3

Während dieser Ansatz eine bessere Methode zur Erfassung mehrfarbiger Bilder mit hoher Auflösung versprach, gab es Herausforderungen bei der Umnutzung der Technologie für die Mikroskopie, nicht zuletzt die Lichtquelle, die bei der ursprünglichen hyperspektralen Bildgebungsmethode die Sonne war. Das viel geringere Lichtsignal, das mit der Mikroskopie einherging, bedeutete, dass niedrige Signal-Rausch-Verhältnisse in der Fluoreszenz angegangen werden mussten. Die hyperspektrale Fluoreszenzbildgebung für die Mikroskopie wurde auch durch die Geschwindigkeit und ein begrenztes Photonenbudget beeinträchtigt.3

Aber diese Hürden schreckten Professor Fraser nicht ab, dem es vor 20 Jahren gelang, die hyperspektrale Detektion für Mikroskope erfolgreich zu implementieren.3 Er verwendete komplexe Mathematik, um die Signale zu entmischen und die Beiträge zu trennen, die von jeder Art von spektraler Emission stammen, die von der mit mehreren Fluorophoren gefärbten biologischen Probe stammt. Kürzlich hat Dr. Cutrale einen robusten Algorithmus gefunden, der nicht nur resistent gegen die Arten von Rauschen ist, die bei der Hyperspektralmikroskopie auftreten, sondern auch einfach genug ist, um nicht nur das einzelne Pixel – das möglicherweise anfälliger für Rauscheffekte ist – zu beschreiben, sondern auch das vollständige spektrale Zusammensetzung der gesamten Probe.3

Entfernen des Rauschens aus der Hyperspektralmikroskopie

Hier kommt die zweite Methode ins Spiel. Wie die hyperspektrale Bildgebung existiert auch die Phasor-Analyse seit Jahrzehnten und ist für die Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebung (FLIM) bereits etabliert. Aber es wurde nicht auf die hyperspektrale Mikroskopie angewendet, das war nicht bis vor drei Jahren, als Dr. Cutrale anfing, an hyperspektralen Phasoren zu arbeiten.3 Er entdeckte, dass es ein leistungsstarkes und effektives Werkzeug war, um das Rauschen aus hyperspektralen Mikroskopiedaten zu entfernen.

Aber es gab noch eine Hürde: Die Forscher mussten sich auf Expertenebene mit der Phasor-Analyse vertraut machen, um wirklich zu verstehen, wie man den Phasor manipuliert, um die Signale zu entmischen und ihre Daten effektiv zu entrauschen. Um dies zu überwinden, integrierte Dr. Cutrale einen hybriden linearen Entmischungsalgorithmus und die teilweise Automatisierung von Standardalgorithmen mit der Vielseitigkeit und Empfindlichkeit des Phasors, um die Signale zu entmischen, und endete mit einer Lösung, die schneller, empfindlicher und viel einfacher zu verwenden war .

Die Geschwindigkeit, Empfindlichkeit und Nutzengewinne dieser kombinierten Methode mit fluoreszierender Hyperspektralmikroskopie und Phasoranalyse ermöglichen es den Forschern, ihre Bilder in Echtzeit aufzunehmen und zu analysieren, was bedeutet, dass alle Fehler sofort korrigiert werden können, indem neue Bilder von aufgenommen werden derselben Probe, was viel schwieriger, wenn nicht sogar unmöglich wäre, wenn die Analyse viel später an den Daten durchgeführt werden müsste – nachdem die Farbstoffe ihre Fluoreszenz verloren haben.2.3

Maschinelles Lernen zur Kartierung der subzellulären Verteilung menschlicher Proteine

Die schnell voranschreitende Rechenleistung trägt auch dazu bei, durch fortschrittliche Mikroskopie im Human Protein Cell Atlas (HPA)-Programm neue Wege in den Biowissenschaften zu beschreiten. DR Emma LundbergProfessor für zellbiologische Proteomik am KTH Royal Institute of Technology in Schweden und Direktor der HPA, entwickelt Modelle für maschinelles Lernen (ML), um die subzelluläre Verteilung der meisten menschlichen Proteine ​​abzubilden und ihre Bewegungen und Interaktionen in Echtzeit zu untersuchen.

Die von ihrem Team entwickelten ML-Algorithmen tragen dazu bei, die Bildsegmentierung in der konfokalen Mikroskopie zu verbessern und eine weitaus effizientere Datenverarbeitung und -analyse zu ermöglichen, einschließlich der Segmentierung von Bildern in mehrere Pixelsätze.4.5 unvoreingenommene Muster in der Proteinverteilung erkennen und sogar subtile Veränderungen in der Zellmorphologie identifizieren.4 Ebenso können in diesen ML-basierten Analysen auch seltene Zelltypen identifiziert werden.4

Diese ML-Modelle können auch räumliche Informationen in ein Format einbetten, das mit anderen Arten der molekularen Charakterisierung integriert werden kann, beispielsweise mit Proteomikdaten oder Einzelzellsequenzierungsdaten.4 Echtzeitanalyse und häufige Zeitraffer-Bildgebung ermöglichen es dem Team auch, dynamische Ereignisse in den Zellen zu beobachten, einschließlich seltener Ereignisse in Zellen, die sie selektiv mit KI-gestützter Mikroskopie abbilden können.4

Erweiterung des Zugangs zur Mikroskopie durch Eliminierung der Komplexität der multispektralen Bildgebung

Obwohl hyperspektrales Entmischen seit einiger Zeit in Satellitenbildern verwendet wird, die die Sonne als Lichtquelle verwendeten, erwies es sich als schwierig, diese Methode für die Mikroskopie zu entwickeln, die durch ein sehr niedriges Signal-Rausch-Verhältnis bei Fluoreszenz behindert wurde. Letztendlich bedurfte es der Kombination mehrerer Methoden, einschließlich zeigerbasierter Analyse und automatischer linearer Entmischung, um zu einer schnellen und zuverlässigen Mikroskopietechnik für die hyperspektrale Entmischung in einem „Plug-and-Play“-Format zu gelangen, auf das ein breiteres Spektrum von Wissenschaftlern zugreifen kann.6 Dies schont die Probe, da nur eine einzige Bildaufnahme erforderlich ist.

Dank der automatisierten hybriden spektralen Entmischung ist die mehrfarbige Fluoreszenzbildgebung jetzt einfacher und schneller und bietet Wissenschaftlern eine ideale Lösung zum Scannen großer Proben oder zum Erfassen schneller dynamischer Prozesse in lebenden Zellen.6 Zusammen mit ML-Algorithmen ermöglichen diese Methoden Forschern, Wissen aus ihren Mikroskopproben zu extrahieren, während sie noch mit ihrer Probe am Mikroskop sitzen, und sich darauf konzentrieren, Ergebnisse zu erzielen, anstatt ihr Mikroskop zu verstehen, was ihnen die Möglichkeit gibt, bessere Daten zu sammeln und bessere Wissenschaft zu betreiben.

Verweise:

1. PElzer P. Multicolor-Mikroskopie: Die Bedeutung des Multiplexing. Leica Mikrosysteme. https://www.leica-microsystems.com/science-lab/multicolor-microscopy-the-importance-of-multiplexing/. Veröffentlicht am 10. Januar 2022. Zugriff am 19. Januar 2022.

2. Polakovic G. Von der Erkennung von Lungenkrebs bis zur Erkennung von Falschgeld – diese neue Bildgebungstechnologie könnte unzählige Anwendungsmöglichkeiten haben. USC-Stammzelle. https://stemcell.keck.usc.edu/from-detecting-lung-cancer-to-spotting-counterfeit-money-this-new-imaging-technology-could-have-countless-uses/. Veröffentlicht am 5. Februar 2020. Zugriff am 11. Februar 2022.

3. Cutrale F, Trivedi V, Trinh L, et al. Die hyperspektrale Phasor-Analyse ermöglicht Multiplex-5D in vivo Bildgebung. Nat-Methoden . 2017 https://doi.org/10.1038/nmeth.4134

4. Lundberg E, Leica Microsystems Unternehmenskommunikation. Anwendung von KI und maschinellem Lernen in der Mikroskopie und Bildanalyse. Leica Mikrosysteme. https://www.leica-microsystems.com/science-lab/applying-ai-and-machine-learning-in-microscopy-and-image-analysis/. Veröffentlicht am 10. Januar 2022. Zugriff am 21. Januar 2022.

5. Petoukhov E. Einsatz von maschinellem Lernen in der Mikroskopbildanalyse. Leica Mikrosysteme. https://www.leica-microsystems.com/science-lab/using-machine-learning-in-microscopy-image-analysis/. Veröffentlicht am 10. Januar 2022. Zugriff am 24. Januar 2022.

6. Amon J, Laskey P. FluoSync – eine schnelle und schonende Methode zum Entmischen mehrfarbiger Weitfeld-Fluoreszenzbilder. Weiße Papiere. Leica Mikrosysteme. https://go.leica-ms.com/FluoSync. Veröffentlicht am 10. Januar 2022. Zugriff am 11. Februar 2022.